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1. 文章导读

传统外科手术治疗肩袖撕裂有着较高的再撕裂率，这是因为单纯将肌腱残端缝合在骨上无法重建肩袖止点处腱骨界面的梯度结构（包含肌腱、软骨及骨组织）。近年来，利用3D打印技术构建组织工程支架模拟天然组织结构受到人们的关注。但是，由于传统的挤出式3D打印技术分辨率较低，不能实现精细化打印，限制了其在腱骨界面修复领域的应用。最近，有研究报道利用电流体动力打印技术制造微纤维支架作为细胞再生的始基，这为实现复杂精细组织结构的仿生重建提供了技术支持。然而，要实现肩袖撕裂后的仿生重建，除了需要量身定制的始基外，还需要大量的干细胞用于组织再生。因此如何在肩袖撕裂处原位补充足够的内源性干细胞仍是亟待解决的一个问题。

近期，西安交通大学第一附属医院骨科尹战海教授联合西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室贺健康教授在SCI期刊《极端制造》（International Journal of Extreme Manufacturing,IJEM）上共同发表《同轴电流体动力打印核壳结构微纤维支架释放层特异性生长因子促肩袖止点再生》的文章，使用同轴电流体动力打印技术制备了一种核壳结构微纤维支架，通过体外实验及动物实验对该支架促肩袖止点再生的能力进行验证。如图1所示，为重建肩袖止点处腱骨界面的梯度结构，以PCL、PEO为生物墨水制备了三层纤维直径及纤维间距不同的微纤维核壳结构支架。每层支架的外壳均负载趋化因子SDF-1，而各层纤维的内核则分别负载bFGF、TGF-β和BMP-2三种特异性生长因子，通过序贯释放支架中的生长因子可原位募集骨髓间充质干细胞并诱导其向肌腱、软骨及骨组织定向分化，以恢复肩袖止点的梯度结构,实现肩袖撕裂后的仿生重建。

亮 点
• 构建了一种具有层结构特异性、成分特异性的梯度支架模拟天然腱骨界面的复杂精细结构。
• 提出原位募集干细胞这一策略，巧妙的解决了修复部位“种子细胞”的来源问题。
• 核壳结构微纤维支架可实现生长因子序贯释放，具有“时空特异性”。

图1 研究示意图

2 研究背景

肩袖撕裂作为一种常见的导致肩部疼痛、肩关节运动受限的疾病在世界范围内日益受到人们的关注。然而，由于肩袖止点处的腱骨界面是一个包含肌腱、软骨及骨组织在内的非均质性组织，现有的肩袖修复技术并不能完全恢复这一复杂的梯度结构，再生的瘢痕组织生物力学强度差，使修复后的肩袖面临较高的再撕裂率，因此如何实现肩袖腱骨界面仿生重建是当前的一项重要挑战。近年来，利用3D打印技术构建组织工程支架已被广泛用于缺损组织的修复，并取得了良好的效果。但是传统的挤出式3D打印技术分辨率低，无法精确模拟肩袖腱骨界面的精细结构，限制了其在肩袖修复领域的应用。电流体动力打印技术的出现打破了这一现状，其打印的微米级纤维支架已被证实具有引导细胞排列、增强细胞黏附及促进细胞增殖的能力，高分辨率的打印精度使其具有定制精细组织结构的潜力。然而，要实现撕裂肩袖的仿生重建，除了打印仿生结构支架作为再生始基外，还需要大量骨髓间充质干细胞作为“种子细胞”。既往研究多是直接向支架中引入外源性骨髓间充质干细胞，然而，引入外源性干细胞除了需要经历复杂的提取及培养过程外，还对受体有一定的致瘤风险，因此如何有效提升肩袖缺损部位的干细胞数量是肩袖修复领域需要解决的一大问题。在本文中，尹战海教授和白浪博士等人开发了一种层特异性核壳结构支架，并通过体外实验及动物实验证实了该支架卓越的促肩袖修复能力，该研究所设计的核壳结构微纤维支架具备一定的临床转化价值，为临床修复肩袖撕裂，降低肩袖术后再撕裂率提供了新的治疗思路。

3 最新进展

最新进展主要分为三个部分：探索核壳结构微纤维支架打印工艺，核壳结构微纤维支架募集干细胞并引导其定向分化的研究，验证核壳结构微纤维支架的在体修复能力。
◆探索核壳结构微纤维支架打印工艺 利用同轴电流体动力打印技术制备核壳结构微纤维支架。如图2所示，同轴打印针头的内核与外壳均采用PCL+PEO作为打印的生物墨水，通过调整同轴针头内核与外壳生物墨水含量比例及生物墨水打印速度，详细研究了对核壳结构纤维形貌的影响因素，进而确定最终的打印参数。

图2 （a）同轴电流体动力打印平台；（b）同轴电流体动力打印过程中喷出的微纤维的放大图像。（c）同轴电流体动力打印核壳结构微纤维，总打印速率固定在50μl·h^-1，同时将内核生物墨水和外壳生物墨水的比例从1:9更改为4:1。（d）内核生物墨水和外壳生物墨水的比例设置为1:1，同时将总打印速率从10μl·h^-1更改为100μl·h^-1。（e）不同内外层生物墨水含量比例（n＝3）的同轴纤维的直径。（f）不同打印速率下同轴纤维的直径（n＝3）。蓝色虚线：外壳结构。绿色虚线：内核结构。

◆核壳结构微纤维支架募集干细胞并引导其定向分化的研究 为证实层特异性核壳结构微纤维支架对干细胞的募集与定向分化的能力，制备了内核负载三种生长因子而外壳不负载SDF-1的对照组（S+D）和内核负载三种生长因子且外壳负载SDF-1的实验组（S+R+D）,如图3所示，Transwell实验证明了S+R+D组支架对BMSC具有显著的趋化能力。

图3 （a）细胞趋化实验示意图；（b）在S+D和S+R+D组中对不同层支架进行12小时和24小时的Transwell测试；（c）培养12小时和（D）培养24小时后跨膜细胞数量的定量结果（n=3） P＜0.001。

图4 S、S+D和S+R+D组中的每层核壳结构微纤维支架上的干细胞定向分化。培养14天后，S、S+D和S+R+D组支架的（a） TNMD、（b） SOX-9和（c） RUNX-2的免疫荧光染色；（d） TNMD、（e） SOX-9和（f） RUNX-2（n=3）的相对表达量。*P＜0.05。

随后对核壳结构微纤维支架引导BMSC定向分化的能力进行验证，在前述两组基础上制备不负载生长因子的纯支架组（S）作为对照。如图4所示，对三组（S、S+D、S+R+D）支架的每一层进行肌腱细胞、软骨细胞及成骨细胞特异性标记物的免疫荧光染色，最终观察到相比于S组和S+D组，S+R+D组三层各自的特异性标记物表达数量均显著增高，证实了S+R+D组微纤维支架引导BMSC在特定层的定向分化能力。

◆验证核壳结构微纤维支架的在体修复能力

通过构建兔肩袖损伤的动物模型，将核壳结构微纤维支架植入损伤部位，如图5所示，在不同时间点获取肩袖标本，对修复的肩袖组织进行组织学及生物力学检测，评估肩袖修复情况。在S+R+D组修复后的肩袖组织中可以看到类似于天然腱骨界面的梯度结构，生物力学检测也证实该组修复后的肩袖有更大的失效载荷，由此证明了本实验制备的层特异性核壳结构微纤维支架通过原位募集骨髓间充质干细胞并诱导其定向分化能有效促进撕裂肩袖的修复，实现肩袖腱骨界面的仿生重建。

图5 （a）支架植入兔肩袖损伤部位。黄色箭头：植入的支架；（b）术后6周和12周修复的冈上肌腱的大体形态。黄色虚线圆圈：肌腱到骨骼的界面；（c）肩袖止点区域的横截面积；（d）修复后的肩袖的最终失效载荷；（e）肩袖重建止点的H&E染色；（f）正常肩袖腱骨界面的H&E染色。绿色星号：肌腱侧。蓝色星号：骨侧。黑色星号：植入支架。黑色箭头：降解的支架。黄色虚线：潮线；（g）修复组织的肌腱成熟度评分。*P＜0.05。

4 未来展望

具有高分辨率的3D打印技术在模拟天然腱骨界面的梯度结构时具有显著的优势，本文提出了一种利用电流体动力打印技术制备核壳结构微纤维支架的方法，并在兔肩袖撕裂模型中观察到了良好的修复效果，然而由于兔肩袖与人肩袖解剖结构的差异，未来有必要使用与人类更相似的大动物模型来进一步验证核壳结构微纤维支架的有效性。另外，本研究最长的观察时间点设定在术后12周，无法有效评估肩袖再生止点组织的长期稳定性及其与骨组织的整合情况，后续实验中可将观察时间延长，更精准全面的评价微纤维支架用于肩袖修复的疗效。